流式实验如何配色

通过阅读相关文献，了解您实验需要选择哪些Marker，以及这些Marker之间的逻辑关系（圈门的父子关系，比如T细胞CD3是“父"，而CD4或者CD8就是“子"）。

对于细胞质或者细胞核的Marker，需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核Marker染色实验操作时，需要先染细胞表面Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内Marker染色。此时细胞表面的Marker尽量避免使用串联染料，因为“固定"容易对串联荧光素造成影响。

确认Marker表达位置的同时，我们还需要了解Marker的表达量。前面提到过“强弱搭配"，我们需要通过表达量的强弱，来搭配荧光素的弱强。

通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类：

步骤三，了解实验所用流式细胞仪的配置信息，包括：流式细胞仪的激光器、检测通道和滤光片等。

上期提到：流式细胞仪是同时检测多种荧光的，这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道，来确认有哪些荧光素可以选择，这样可以在后期搭配的时候，尽量避免干扰。如果没有仪器的通道信息，是无法去确定哪些荧光素可供选择的。可以说，如果没有仪器通道信息，配色就是“无源之水，无本之木"。

通过仪器通道信息，确认可以选择哪些荧光素后，我们还需要了解荧光素的信息，确认这些荧光素的激发波长和发射波长、接收该荧光的滤光片等信息，是否和流式细胞仪的通道一致。

▲ 常见荧光基团信息

强表达抗原，可以选择弱荧光素，也可以选择强荧光素。

如下图所示，强表达抗原CD3，选择弱荧光素FITC或强荧光素APC，对实验结果影响不大。

弱表达抗原，一定要选择强荧光素。

如下图所示，弱表达的抗原CD25，选择弱荧光素PerCP，会导致阴阳性细胞群分不开。如果选择强荧光素PE，可以看到明显的阳性细胞群。

当然，有些老师在配色时，也会遇到一些其他的问题，如：细胞样本有自发荧光、细胞处理容易出现死细胞（需要额外增加死活细胞染料）等。因此，我们需要特别注意，将对应通道的荧光检测信息，预留给自发荧光，或者死活染料检测。

相信在了解了流式配色的基本原则及操作步骤后，大家的实验也能更加顺利地开展啦~

配色是一个需要多因素考虑的工作，如果您在阅读完本文后，具体操作时还是不清楚如何配色，欢迎填写下面的配色服务需求表，我们的技术支持会给您提供专业的免费配色服务。

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