Annexin V‑FITC/PI检测体系下细胞凋亡流式检测技术要点

　　细胞凋亡属于细胞程序性死亡，是机体维持细胞稳态的重要生理过程，参与胚胎发育、免疫细胞筛选、组织损伤修复等多种生理活动，同时也和肿瘤发生发展、药物毒性、炎症损伤等病理过程密切相关。在细胞生物学、药理学相关研究当中，定量检测细胞凋亡水平是十分常见的实验需求，AnnexinV‑FITC结合PI的双染流式检测方法，凭借操作流程简便、检测周期短的特点，被广泛应用于各类细胞样本的凋亡状态分析。

　　该检测体系的核心原理建立在凋亡发生过程中细胞膜磷脂分布的改变。正常活细胞的磷脂酰丝氨酸（PS）分布在细胞膜内侧，细胞发生早期凋亡的时候，细胞膜磷脂不对称分布被打破，磷脂酰丝氨酸外翻暴露到细胞膜外侧。AnnexinV属于钙离子依赖性磷脂结合蛋白，和磷脂酰丝氨酸具备很高的亲和能力，标记FITC荧光的AnnexinV就可以结合外翻的磷脂酰丝氨酸，标记出处于凋亡早期的细胞。PI属于核酸染料，完整的细胞膜可以阻挡PI进入细胞，只有当细胞进入凋亡晚期或者发生细胞坏死，细胞膜完整性丧失，PI才能够穿透细胞膜结合胞内双链DNA，产生荧光信号。通过AnnexinV‑FITC与PI两种染料联合染色，就可以把细胞划分为活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞以及坏死细胞不同群体，借助流式细胞仪完成各个细胞群体的统计分析。
 

　　整套检测的样本对象为细胞样本，不管是悬浮培养细胞，还是贴壁培养细胞都可以适用，整体检测耗时约40分钟，对应流式细胞仪FITC检测通道。贴壁细胞样本处理环节需要格外注意，诱导细胞凋亡处理之后，培养体系当中既有已经脱落的凋亡悬浮细胞，也还有贴附在培养板底部的细胞，收集样本时必须同时收集培养基内悬浮细胞和消化得到的贴壁细胞，如果只收集贴壁细胞，会丢失大量凋亡细胞，造成最终凋亡比例结果偏低。消化操作尽量选择不含EDTA的消化试剂，EDTA会螯合钙离子，钙离子是AnnexinV结合磷脂酰丝氨酸所必需的离子环境，EDTA的存在会干扰染料结合，带来实验结果偏差；消化过程动作尽量温和，过度消化、剧烈吹打会人为造成细胞膜破损，人为引入PI阳性信号，干扰真实凋亡水平的判断。

　　样本洗涤重悬环节，需要使用试剂盒配套的结合缓冲液，维持合适钙离子浓度，保障AnnexinV和磷脂酰丝氨酸有效结合。完成细胞洗涤之后，调整合适的细胞浓度，再依次加入AnnexinV‑FITC和PI染料，混匀之后避光室温孵育，孵育完成之后短时间内完成上机检测，不建议染色之后长时间放置，一方面荧光染料存在光敏属性，长时间光照会发生淬灭；另一方面体外环境下细胞凋亡进程会持续推进，细胞群体状态会持续发生改变，造成检测结果偏离真实的样本状态。

　　试剂盒的储存运输同样有明确要求，试剂需要在2‑8摄氏度避光条件保存，有效期12个月，运输采用冰袋低温运输。整个染色操作全程需要避光，光照会造成FITC荧光淬灭，降低信号强度，影响分群效果。PI染料具备一定毒性，实验操作过程当中需要做好个人防护，避免直接接触皮肤黏膜。流式上机检测之前，除待测样本管，还需要准备空白细胞管，AnnexinV‑FITC单染管，PI单染管，空白管用于调节仪器电压，两支单染管用来完成FITC与PI通道之间的荧光补偿校准，消除光谱重叠带来的信号干扰，如果补偿设置不当，会造成凋亡各个细胞群体的分群界限模糊，无法准确统计各个亚群比例。

　　在药物药理研究当中，该检测方法经常用于评估药物处理之后肿瘤细胞、免疫细胞的凋亡变化；细胞损伤模型当中，用来分析刺激因素诱导的细胞程序性死亡水平。实验过程当中，样本处理、染料孵育、上机检测的每一步操作都会对最终结果产生影响，理解检测原理，规范样本收集消化流程，做好避光操作，合理设置对照与荧光补偿，能够减少人为带来的实验误差，得到稳定可重复的细胞凋亡检测数据，为细胞生物学相关课题提供有效的实验依据。